WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Роль ендотеліальної дисфункції в патогенезі гломерулонефриту (експериментально-клінічне дослідження) (автореферат) - Реферат

Роль ендотеліальної дисфункції в патогенезі гломерулонефриту (експериментально-клінічне дослідження) (автореферат) - Реферат

5. [Cа2+]і-сигналізація при активації ріанодинових рецепторів секреторних клітин підщелепної слинної залози

Молекулярно-біологічними дослідженнями виявлено (Giannini et al., 1995) наявність у тканині підщелепної слинної залози мРНК, відповідальної за експресію ріанодинових рецепторів та доведено (Lee et al., 1997) їх наявність в ацинарних клітинах цієї залози. З іншого боку, при активації ріанодинових рецепторів не виявлено змін [Cа2+]і (Seo et al., 1997), тому питання їх функціональної активності в ацинарних клітинах слинних залоз залишається відкритим.

Підтвердження функціонування ріанодинових рецепторів в ацинарних клітинах. З'ясувалось, що у пермеабілізованих ацинарних клітинах кофеїн викликає дозозалежне зменшення в них сумарного вмісту кальцію на 20  5 %, 31  7 % та 42  7,5 % (p<0,05; n=10) при дії відповідно 0,2, 0,5 та 1 ммоль/л кофеїну та 77  5 %, 81  10 %, 86  11,5 %, 89  3 % (p<0,01; n=3) при підвищенні концентрації кофеїну до 10, 20, 30 та 40 ммоль/л. Шляхом реєстрації зміни [Ca2+]ЕР нами показано кофеїн-індуковане зменшення [Ca2+]ЕР (ЕС50 по кофеїну становить 7,3 ммоль/л), яке було нечутливим до гепарину, а, отже, не опосередковується активацією ІnsP3-рецепторів. Кофеїн-індуковане зменшення [Ca2+]ЕР блокувалося високими концентраціями ріанодину (100 мкмоль/л, рис.5А) та потенціювалось ріанодином у середніх концентраціях (10 мкмоль/л, рис.5Б), що є класичними ознаками ріанодинового рецептора. Отже, в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози наявні функціонально-активні ріанодин-чутливі рецептори.

Зміни [Cа2+]і при активації ріанодинових рецепторів. При аплікації кофеїну (10-40 ммоль/л) до інтактних ацинарних клітин нами, як і іншими авторами (Seo et al., 1997), не виявлено достовірних змін [Ca2+]i, причому, відсутність [Ca2+]і-відповіді не пов'язана із спустошенням депо Ca2+, оскільки наступна аплікація АХ супроводжувалась генерацією [Ca2+]і-транзиєнту значної амплітуди. Змін [Ca2+]i не спостерігалось також при аплікації кофеїну на фоні блокування Са2+-АТФаз ПМ чи Са2+-АТФаз ЕР, лише при заблокованих МХ кофеїн (30 ммоль/л) викликав незначне підвищення [Ca2+]i на 48  4 нмоль/л (n=8, p<0,001). Оскільки таке підвищення [Ca2+]i не відповідало кофеїн-індукованому [Ca2+]ЕР-транзиєнту, ми припустили можливість швидкого виведення Са2+ із цитоплазми системами активного його транспорту. Дійсно, генерація [Ca2+]i-транзиєнту при дії кофеїну спостерігалась лише при одночасному попарному блокуванні МХ разом з Са2+-АТФазою ПМ чи МХ і Са2+-АТФазою ЕР. Амплітуда кофеїн-індукованого [Ca2+]i-транзиєнту на фоні ванадату (10 мкмоль/л) та СССР (10 мкмоль/л) становила 176  68 нмоль/л (n=6, p<0,001), тапсигаргіну (3 мкмоль/л) та СССР – 137  40 нмоль/л (n=6, p<0,001).

Отже, ріанодинові рецептори, очевидно, просторово колокалізовані з МХ та Са2+-АТФазами. При цьому Са2+, який вивільняється при активації ріанодинових рецепторів, практично повністю захоплюється МХ, оскільки прикладання 10 мкмоль/л СССР одразу після кофеїну супроводжувалось різким викидом Са2+ з МХ і зростанням [Ca2+]i на 184  39 нмоль/л (n=5, p<0,001, рис. 6).

Електронно-мікроскопічний аналіз розташування мітохондрій в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози. Дослідження ультраструктури клітин підщелепної слинної залози щурів виявило локалізацію МХ у безпосередній близькості до ЕР, більше того, оточення МХ ламелами ЕР (рис.7В). У 36 досліджуваних клітинах щільність МХ, розташованих біля ЕР, була вищою, ніж в інших регіонах клітини, а форма МХ, оточених ламелами, – більш витягнутою, порівняно з іншими МХ, що може бути обумовлено збільшенням площі контакту між мембранами органел. Таким чином, близьке розташування МХ біля ЕР підтверджує припущення про їх колокалізацію із структурами ЕР та свідчить про можливість контактів між Ca2+-транспортними системами ЕР і МХ.

В ацинарних клітинах підщелепної слинної залози спостерігалося також характерне угрупування МХ у базальному полюсі клітини (рис.7Б). З огляду на те, що МХ переважно локалізуються в областях підвищення [Ca2+]i, ми припускаємо, що група МХ в області між ПМ та ЕР, очевидно, відіграє роль регуляторів входу Ca2+ через депо-керовані Са2+-канали ПМ.

6. Базальний витік Са2+ з ЕР ацинарних клітин підщелепної слинної залози

У стані спокою [Ca2+]ЕР підтримується шляхом активного захоплення кальцію Са2+-АТФазою ЕР на фоні його стаціонарного пасивного витоку (Hofer et al.,1999). Витік Са2+ є характерною особливістю ЕР, однак у клітинах слинних залоз залишається невивченим. Для візуалізації та дослідження механізмів пасивного витоку Са2+ ми провели: i) перфузію ацинарних клітин безкальцієвим НДВ-розчином (1 ммоль/л EГTA) для пригнічення прямого (але не реверсивного) режиму роботи Са2+-АТФази ЕР; ii) блокування обох режимів роботи Са2+-АТФази ЕР тапсигаргіном.

Сумарний вміст кальцію у пермеабілізованих клітинах зменшувався після тривалого (20 хв) інкубування їх у безкальцієвому НДВ-розчині на 30  4 %, з тапсигаргіном ([Ca2+]і=100нмоль/л) – на 29  4 %, з тапсигаргіном у безкальцієвому НДВ-розчині – на 36  6,5 % (p<0,01; n=8). За цих умов зареєстровано також зменшення [Ca2+]ЕР. Аналіз амплітуди зменшення F360/F390, характеристичного часу (), розрахованого шляхом апроксимації зміни F360/F390 за допомогою експоненти, та лінійної швидкості показав наявність SERCA-залежного та -незалежного компонентів пасивного витоку Са2+ (табл.3). Причому, переважаючим є витік Са2+ не опосередкований роботою Са2+-АТФази ЕР, тоді як SERCA-залежне виведення Са2+ шляхом реверсивного режиму роботи становить близько ~ 35 %.

Відповідно, можна припустити, що витік Са2+ з ЕР здійснюється через Са2+-канали InsP3- і ріанодинового рецепторів, однак, зменшення [Ca2+]ЕР було нечутливим до гепарину (300 мкг/мл) та рутенієвого червоного (10 мкмоль/л), але дозозалежно потенціювалося пуроміцином – інгібітором синтезу білка. Антибіотик пуроміцин від'єднує новоутворені поліпептиди від транслоконного комплексу мембрани ЕР, в результаті чого транслоконова пора стає проникною для Са2+ (Simon &Blobel, 1991). Викликане пуроміцином (500 мкмоль/л) зменшення [Ca2+]ЕР було нечутливим до гепарину, рутенієвого червоного та тапсигаргіну, а характеристичний час достовірно не відрізнявся від викликаного тапсигаргіном ( = 244 52 с), що свідчить про те, що SERCA-незалежний витік Са2+ здійснюється через транслокон. Крім того, ефект пуроміцину не спостерігався на фоні 200 мкмоль/л анізоміцину, який селективно блокує такий механізм витоку Ca2+ (рис.8).

Отже, в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози базальний витік Са2+ з ЕР не опосередковується Са2+-каналами чи порушенням роботи Са2+-АТФази, а здійснюється через пору транслоконного комплексу.

7. Дослідження депо-керованого входу Са2+ у секреторні клітини підщелепної слинної залози

Єдиним відомим механізмом входу Са2+ у незбудливі клітини є активація депо-керованих Са2+-каналів ПМ (Putney, 1986; Ambudkar, 2000; Shuttleworth, 2004), механізми активації та інактивації якого залишаються остаточно нез'ясованими. Ми вивчали, чи існує залежність між способом спустошення депо ЕР і тривалістю дії агоністів та активацією входу Са2+ ззовні. Для активації входу Са2+ індукували різні шляхи спустошення ЕР кальцієм: і) блокування Са2+-АТФази ЕР, іі) активація ІnsР3- чи ріанодинових рецепторів. Згідно проколу експерименту інтактні ацинарні клітини інкубували у безкальцієвому зовнішньоклітинному середовищі з відповідним агоністом, після чого перфузували клітини кальцієвмісним розчином.

Блокування Са2+-АТФази ЕР тапсигаргіном призводило до активації потужного входу Са2+ у клітини з амплітудою 186 50 нмоль/л (p<0,01; n=10, табл.4, рис.10), тоді як інкубування клітин у безкальцієвому середовищі без тапсигаргіну (незалежно від тривалості), не призводило до змін [Ca2+]і. Свідченням того, що зареєстрований [Ca2+]і-транзиєнт опосередкований активацією депо-керованих Са2+-каналів ПМ, є його пригнічення на 69  12 % (n=3) 2-аміноетоксидифеніл боратом (50 мкмоль/л) – специфічним блокатором SOC-каналів ПМ (Bootman et al., 2002).

Вхід Са2+, індукований InsP3-чутливим спустошенням ЕР, залежав від тривалості дії/кількості аплікацій АХ – найбільшої амплітуди був при тривалому (5 хв) спустошенні депо АХ та сумісній дії АХ і тапсигаргіну. Спустошення ріанодин-чутливого депо Са2+ також активувало вхід Са2+, хоча й значно меншої амплітуди. При цьому кінетика розвитку депо-керованих [Ca2+]i-транзиєнтів, яка вважається показником кількості відкритих SOC-каналів, достовірно не відрізнялась між собою, незалежно від способу спустошення ЕР (агоністами чи блокаторами), що свідчить про єдиний механізм активації входу Са2+ ззовні (табл.4).

Loading...

 
 

Цікаве