WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Роль ендотеліальної дисфункції в патогенезі гломерулонефриту (експериментально-клінічне дослідження) (автореферат) - Реферат

Роль ендотеліальної дисфункції в патогенезі гломерулонефриту (експериментально-клінічне дослідження) (автореферат) - Реферат

Виведення Са2+ є важливим компонентом стимульованої секреції екзокринними клітинами і може бути зумовлено як активацією секреції електролітів, так і виведенням Са2+ разом із вмістом секреторних гранул (Liu et al., 1998). Підтвердженням цього є підвищення концентрації Са2+ у секретованій слині на 245 21 % (n=8, p<0,001) при стимуляції пілокарпіном, яке не спостерігалось після попередньої атропінізації тварин. В той же час активація М-холінорецепторів invitroсупроводжувалась підвищенням сумарного вмісту кальцію в ацинарних клітинах, яке також повністю елімінувалось атропіном. Зокрема, при дії АХ (5 мкмоль/л) вміст кальцію у клітинах підвищувався на 80 8 % (n=7; р<0,01), карбахолу (5 мкмоль/л) – на 60 7 % (n=7; р<0,01), пілокарпіну (5 мкмоль/л) – на 22 3 % (n=6; р<0,01). Отже, зміни слиновиділення in vivo та вмісту кальцію у клітинах in vitro свідчать про те, що холінергічна стимуляція слиновиділення підщелепною слинною залозою опосередковується змінами Са2+-гомеостазу в ацинарних клітинах.

2.Пермеабілізовані клітини як модель для вивчення Са2+-транспортних систем внутрішньоклітинних органел

Оскільки секреція екзокринними клітинами ініціюється підвищенням [Са2+]і, опосередкованим, в основному, вивільненням Са2+ з ЕР, то для дослідження функціонування Са2+-транспортних систем внутрішньоклітинних органел ми пермеабілізували ПМ клітини з використанням неіонних детергентів дигітоніну та -есцину. Виявилось, що ефекти дигітоніну на вміст сумарного кальцію у пермеабілізованих клітинах та білка у середовищі їх інкубування (як інтегрального показника секреції) виражено залежали від концентрації детергенту та часу його дії.

Дигітонін викликав двохфазне підвищення вмісту загального білка: у концентрації 20 мкг/мл – на 10  1,3 % (n=7; p<0,05) та у концентрації 100 мкг/мл і вище – на 17  2 % (n=7; p<0,01). Динаміка змін сумарного вмісту кальцію у клітинах та секреції ними білка мала дзвоноподібний вигляд з максимумом при концентрації дигітоніну 20-50 мкг/мл протягом перших 5 хв його дії. Вже через 2,5 хв дії 20 мкг/мл дигітоніну вміст білка зростав на 21 0,2 % (n=6, p<0,001), сумарний кальцій – на 48 16 % (n=6; р<0,05). Таке підвищення обумовлено дигітонін-індукованим порушенням ПМ та вивільненням вмісту секреторних гранул, а також накопиченням кальцію в ЕР за рахунок роботи Са2+-АТФази у АТФ-вмісному НДВ-розчині. Низхідна гілка кривої, отримана при більш тривалій інкубації клітин з дигітоніном (5-15 хв) чи високими його концентраціями (50-200 мкг/мл), обумовлена порушенням цілісності мембран внутрішньоклітинних органел та втратою ними білків і Са2+.

Підтвердженням ефективної пермеабілізації ПМ дигітоніном (20 мкг/мл) є вимивання флуоресцентних Са2+-барвників із цитоплазми та зниження інтенсивності флуоресцентного сигналу у пермеабілізованих клітинах. У випадку фура 2/АМ сигнал падав практично до фонового рівня, у випадку маг-фура 2/АМ – зменшувався в середньому на 60-80 % від початкового, решта (40-20 %) відображає світіння барвника всередині депо Са2+ (рис.1). Подальша перфузія клітин НДВ-розчином, який містив 3 ммоль/л АТФ, супроводжувалась зростанням співвідношення F360/F390 (рис.1), що відповідає підвищенню [Ca2+]ЕР, тоді як за відсутності АТФ, як і при дії тапсигаргіну, спостерігалось зменшення [Ca2+]ЕР. Таким чином, тапсигаргін-інгібована АТФ-залежна акумуляція Са2+ у депо ЕР свідчить про функціональну цілісність ЕР після обробки клітин дигітоніном.

Для вивчення процесів [Ca2+]і-сигналізації при активації рецепторів ПМ ми розробили модель пермеабілізації клітини за допомогою -есцину. Так, пермеабілізовані -есцином клітини, як і оброблені дигітоніном, здійснюють АТФ-залежне накопичення Са2+ в ЕР, а підтвердженням того, що -есцин не порушує цілісності рецептор-зв'язаних сигнальних шляхів, є зареєстрований [Ca2+]ЕР-транзиєнт при дії АХ (рис.2). Отже, пермеабілізовані клітини є адекватною моделлю як дослідження механізмів підтримання гомеостазу Са2+ у внутрішньоклітинних депо (дигітонінова модель), так і ролі ЕР у [Ca2+]і-сигналізації (-есцинова модель).

3. Функціонування тапсигаргін-чутливого та -нечутливого депо Са2+ в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози

Для виявлення гетерогенності внутрішньоклітинних депо Са2+ в ацинарних клітинах ми підібрали умови максимального спустошення ЕР тапсигаргіном та АХ. При дослідженні динаміки тапсигаргін-індукованих змін сумарного вмісту кальцію в інтактних клітинах виявлено підвищення вмісту кальцію у кальцієвмісному середовищі та зменшення – у безкальцієвому. Максимальним ефект тапсигаргіну (0,1 мкмоль/л) був після 20-ти хвилин його дії як в інтактних, так і у пермеабілізованих ацинарних клітинах. При цьому кількість кальцію, який вивільняється при блокуванні Са2+-АТФази ЕР, складало ~ 30 % від загального його вмісту у депо. АХ (5 мкмоль/л), як і тапсигаргін, викликав подібні зміни сумарного вмісту кальцію в інтактних та пермеабілізованих клітинах, однак ефект АХ максимальним був після 10 хв його дії.

Для з'ясування того, чи мішенню дії тапсигаргіну і АХ є одне і те ж депо Са2+, клітини попередньо преінкубували 20 хв з тапсигаргіном, після чого інкубували 10 хв з АХ. Виявилось, що після спустошення депо тапсигаргіном АХ (5 мкмоль/л) викликав додаткове підвищення сумарного вмісту кальцію ще на 38  3 % (р<0,01; n=8) в інтактних клітинах (рис.3А) і зменшення ще на 38  7 % (р<0,01; n=9) – у пермеабілізованих (рис.3Б), яке повністю елімінувалось гепарином – блокатором ІnsР3-чутливого вивільнення Са2+.

У зафарбованих фура 2/AM клітинах тапсигаргін викликав підвищення [Ca2+]і, максимальне на 20 хв дії, яке у кальцієвмісному середовищі було платоподібним з амплітудою 112 11 нмоль (n=8, рис.4), а у безкальцієвому – транзиєнтного характеру (амплітуда 51 14 нмоль/л (n=6). При аплікаціях АХ на фоні тапсигаргіну зареєстровано градуальне зменшення амплітуди [Ca2+]і-транзиєнтів у кальцієвмісному (рис. 4) та безкальцієвому розчинах. Додаткове підвищення Са2+ (сумарного та іонізованого), свідчить про те, що тапсигаргін не повністю спустошує ІnsР3-чутливе депо Са2+.

Прямим доказом наявності тапсигаргін-нечутливого депо Са2+ є зменшення [Ca2+]ЕР при дії окремо АХ, ванадату (блокатору Са2+-АТФаз широкого спектру дії) чи іономіцину (іонофору, який призводить до вивільнення Са2+ у рецептор- та енергонезалежний спосіб) після попереднього спустошення ЕР тапсигаргіном. Зокрема, тапсигаргін (3 мкмоль/л) викликав зменшення [Ca2+]ЕР на 0,045 0,006 (n=12), а наступна аплікація 100 мкмоль/л ванадату на фоні тапсигаргіну супроводжувалась подальшим зменшенням F360/F390 ще на 0,042 0,008 (n=6). Характерно, що ефекту АХ не спостерігалось після спустошення депо тапсигаргіном та ванадатом, тоді як на фоні лише тапсигаргіну АХ (5 мкмоль/л), як і іономіцин (10 мкмоль/л), викликав виражене зменшення [Ca2+]ЕР.

Отже, в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози функціонує тапсигаргін-чутливе та тапсигаргін-нечутливе депо Са2+, обоє з яких є ІnsР3-залежними.

4. Властивості та регуляція інозитолтрифосфат-чутливих рецепторів ацинарних клітинпідщелепної слинної залози

У незбудливих клітинах вивільнення Ca2+ через InsP3-рецептор відіграє основну роль у визначенні просторово-часових параметрів Ca2+-сигналізації (Ambudkar, 2000; Berridge, 2002). Для з'ясування механізмів ІnsР3-чутливого вивільнення Са2+ ми провели реєстрацію зміни [Са2+]ЕР при активації холінорецепторів ПМ АХ та безпосередньо InsP3-рецепторів екзогенним InsP3.

Амплітуда АХ-індукованого [Ca2+]ЕР-транзиєнту становила 0,1 0,02, розрахований час напівспаду – 28 2 с (n=23, р<0,001, рис.2). Викликана InsP3 [Ca2+]ЕР-відповідь прямо залежала від концентрації агоніста з ефективною концентрацією InsP3 (ЕС50) – 1,3 мкмоль/л. Зменшення [Ca2+]ЕР при дії АХ та InsP3 ефективно блокувалось гепарином, отже, опосередковане активацією тільки InsP3-рецепторів. Для дослідження залежності ІnsР3-індукованого зменшення [Ca2+]ЕР від цитозольного кальцію [Ca2+]і у НДВ-розчині фіксували на рівні 30, 100, 400 і 2000 нмоль/л. Викликане ІnsР3 (1, 3, 5 мкмоль/л) зменшення [Ca2+]ЕР потенціювалося Ca2+ при фізіологічних його концентраціях (100-400 нмоль/л), а подальше підвищення [Са2+]і інгібувало вивільнення Ca2+ (табл. 2).

Для багатьох об'єктів показано, що активність ІnsР3-рецептора, подібно до [Са2+]і, модулюється АТФ (Ferris &Snyder, 1992;Bezprozvanny & Ehrlich, 1993). З'ясувалось, що в ацинарних клітинах ефект АТФ на ІnsР3-індуковане зменшення [Ca2+]ЕР залежить від концентрації АТФ: є позитивно кооперативним при низьких концентраціях та негативно кооперативним – при високих. Зокрема, за наявності у НДВ-розчині 0,5, 1 та 2 ммоль/л АТФ амплітуда ІnsР3-індукованого [Са2+]ЕР-транзиєнту зростала на 14 1 %, 27 5 % та 28 6 % (n=6), порівняно з таким при 3 ммоль/л АТФ. У присутності 10 і 20 ммоль/л АТФ спостерігалось, навпаки, зменшення [Са2+]ЕР-відповіді на 5 0,3 % (p<0,05) та 15 3 % (n=6, p<0,01).

Виявлено також здатність кофеїну (4 ммоль/л) пригнічувати InsP3-індуковане вивільнення Са2+ на 11 3 % (n=9, p<0,05), що, однак, не спостерігалось при дії InsP3 у субмаксимальній концентрації (20 мкмоль/л). Пригнічуючого ефекту кофеїну не спостерігалось і в присутності АТФ (1 ммоль/л), навпаки – потенціювання InsP3-індукованого зменшення [Ca2+]ЕР на 65 12 % (р<0,01; n=8), порівняно до такого без АТФ.

Отже, активація ІnsP3-рецепторів індукує дозозалежне вивільнення Ca2+ з ЕР, яке є максимальним при значенні [Са2+]і у фізіологічних межах, пригнічується кофеїном та модулюється АТФ.

Loading...

 
 

Цікаве