WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Роль ендотеліальної дисфункції в патогенезі гломерулонефриту (експериментально-клінічне дослідження) (автореферат) - Реферат

Роль ендотеліальної дисфункції в патогенезі гломерулонефриту (експериментально-клінічне дослідження) (автореферат) - Реферат

Особистий внесок здобувача полягає у виконанні всього обсягу експериментальних досліджень, поданих у дисертаційній роботі, статистичному опрацюванні результатів, підборі та обробці даних літератури, а також, за участю наукового керівника, у плануванні напрямків досліджень, розробці методик пермеабілізації ПМ ацинарних клітин, вимірювання концентрацій іонізованого кальцію у цитоплазмі та ЕР, аналізі одержаних результатів, формулюванні висновків.

У роботі використано обладнання, надане старшим науковим співробітником Інституту фізіології імені О.О. Богомольця НАН України д.б.н. Войтенко Н.В. Електронно-мікроскопічні дослідження проведено спільно із співробітником Інституту фізіології імені О.О. Богомольця НАН України к.б.н. Півневою Т.А.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень та основні положення, включені до дисертації, були представлені на: VII міжнародному медичному конгресі студентів та молодих вчених (Тернопіль, 2003 р.), I з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004 р.), науково-практичній конференції "Сечєнов та Одеська школа фізіологів" (Одеса, 2004 р.), Міжнародній школі-семінарі IBRO "Receptors, Channels, Messengers" (Ялта, 2004 р.), І Українській науковій конференції "Прoблеми бiологiчної і медичної фізики" (Xapків, 2004 р.), Міжнародній конференції "Клітинні та субклітинні механізми функціонування травної системи" (Львів, 2004 р.), регіональному біофізичному з'їзді (Zrece, Словенія, 2005 р.), XXXV Міжнародному Конгресі фізіологічних наук (Сан-Дієго, США, 2005 р.), III Конференції товариства нейронаук (Донецьк, 2005 р.), XV Міжнародному біофізичному конгресі (Монтпельєр, Франція, 2005 р.), семінарах кафедри фізіології людини і тварин (2002-2005 рр.), щорічних звітних конференціях біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка (2002-2005 рр.) та на міжкафедральному семінарі біологічного факультету у липні 2005 р.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 5 статей у фахових наукових журналах та 10 тез доповідей у матеріалах міжнародних та українських наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 200 сторінках і включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень, їх обговорення, висновки та список використаної літератури з 313 джерел. Робота ілюстрована 81 рисунком і 7 таблицями.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Визначення показників слиновиділення підщелепною слинною залозою щурів. Експерименти проводили на щурах-самцях лінії Вістар віком 1,5 міс. Відбір слини проводили за модифікованою методикою, запропонованою для привушної слинної залози щурів (Kawaguchi еt al., 2000). Перед початком експерименту тварину наркотизували ін'єкцією кетаміну та лістенону. Слину, яка виводилась протоками підщелепної слинної залози, відбирали канюлею, якy впритул підводили до проток підщелепної слинної залози. Виділення слини оцінювали за швидкістю слиновиділення, α-амілолітичною активністю слини, вмісту у ній загального білка та концентрації Са2+.

Ізолювання ацинарних клітин підщелепної слинної залози. Перед початком гострого експерименту тварину наркотизували ефіром і проводили швидку декапітацію. Ацинарні клітини підщелепної слинної залози ізолювали шляхом піпетування тканини залози після її ферментативної обробки у базовому зовнішньоклітинному розчині, який містив колагеназу (тип І, 270 од/мг), протягом 25-30 хв (35 оС). Базовий зовнішньоклітинний розчин містив (у ммоль/л): NaCl – 140; KCl – 4,7; CaCl2 – 1,3; MgCl2 – 1,0; гідроксиетилпіперазин-N-2-етансульфонову кислоту (HEPES) – 10; глюкоза – 10 ммоль/л; рН 7,4.

Визначення сумарного вмісту Са2+ у клітинах та секреції ними білка. Сумарний вміст Са2+ в ацинарних клітинах визначали фотоколориметрично з використанням металохромного барвника арсеназо ІІІ. Принцип методу полягає у тому, що Са2+ утворює з арсеназо III комплекс синього кольору, інтенсивність забарвлення якого еквівалентна концентрації Са2+ у пробі. Вміст кальцію виражали в наномолях у перерахунку на 1 мкг білка, який визначали за методом Лоурі (Lowry et al., 1951). Секрецію загального білка ацинарними клітинами виражали у процентах від сумарного вмісту білка у гомогенаті та супернатанті.

Вимірювання [Са2+]i в ацинарних клітинах. [Са2+]i в ацинарних клітинах реєстрували з використанням мембранно-проникної форми флуоресцентного Са2+-барвника фура-2/АМ. Для завантаження барвника суспензію клітин інкубували у базовому розчині, який містив 5 мкмоль/л фура-2/АМ, протягом 30-40 хв при 35С, після чого відмивали базовим розчином і додатково інкубували протягом 30 хв для повної деетерифікації барвника. Для точного визначення [Ca2+]i використовували формулу Грінкевича (Grynkiewicz et al., 1985): [Ca2+]i = Kd B (R – Rmin) / (Rmax – R).

Значення констант, одержані шляхом калібрування, становили: Rmin=0,9, Rmax=19, В=26. Параметр Kd становив 224 нмоль/л (Grynkiewicz et al., 1985).

Хімічна пермеабілізація ацинарних клітин. Ацинарні клітини пермеабілізували дигітоніном та -есцином. Робочу концентрацію детергентів та час інкубування клітин з ними підбирали експериментально. Детергенти вносили до розчину, складом наближеного до внутрішньоклітинного середовища (НДВ), який містив (у ммоль/л): KCl – 120; NaCl – 20; MgSO4 – 2; HEPES – 10; АТР – 3; EGTA – 1; CaCl2 – 0,75; рН 7,2. Концентрація іонізованого Са2+, розрахована за допомогою програми "WinMAXC v2.10", у такому НДВ-розчині становила ~250 нмоль/л. Тривалість інкубування клітин з дигітоніном (20 мкг/мл) становила 2-5 хв у всіх експериментах, за виключенням окремо згадуваних, з -есцином (40 мкг/мл) – 3-6 хв. Пермеабілізацію клітин контролювали візуально з використанням трипанового синього (0,4 %) під світловим мікроскопом, а у випадку маг-фура 2/АМ-зафарбованих клітин оцінювали за падінням флуоресцентного сигналу Са2+-барвника.

Визначення [Ca2+]ЕР у секреторних клітинах. Для моніторингу концентрації Са2+ в ЕР, ацинарні клітини завантажували мембранно-проникною формою низько-афінного флуоресцентного Са2+-барвника маг-фура 2/АМ. Фарбування клітин проводили протягом 45-60 хв при 37С, що забезпечує компартменталізацію барвника у внутрішньоклітинних органелах (Hofer & Machen, 1993). Зміни [Ca2+]ЕР виражали не як абсолютне значення, а як співвідношення інтенсивності флуоресцентного сигналу маг-фура 2/АМ на довжині хвилі збудження 360 нм до такої на 390 нм (F360/F390) і оцінювали як прямо пропорційні до змін співвідношення F360/F390 (Hofer & Machen, 1994).

Метод електронної мікроскопії. Ізольовані ацинарні клітини фіксували протягом 12 год при 20С у суміші розчинів глютаральдегіду (2 %) та параформальдегіду (2 %), приготовлених на 0,1 моль/л фосфатному буфері (рН 7,2-7,4). Дофіксацію проводили в 1 % розчині OsO4 у фосфатному буфері протягом 1 год при кімнатній температурі. Зразки зневоднювали у зростаючих концентраціях спиртів та заливали в епоксидну смолу (аралдит) при поступовій заміні ацетону епоксидною смолою. Ультратонкі зрізи отримували за допомогою ультрамікротому ІІІ (LKB, Швеція) і контрастували у розчині нітрату свинцю та уранілацетату. Дослідження проводили на електронному мікроскопі JEM 100 (JEOL, Японія) при 80 кВ із збільшенням 5000 – 40000.

Оригінальні записи [Ca2+]і та [Ca2+]ЕР опрацьовували за допомогою програм Tida 5.0 (Німеччина). Статистичну обробку результатів здійснювали з використанням Microsoft Excel, аналіз змін співвідношення F360/F390 проводили за допомогою Microcal Origin. Достовірність змін встановлювали за t-критерієм Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

1.Кальцій-залежні зміни функціонування ацинарних клітин підщелепної слинної залози щурів при активації холінорецепторів

Для з'ясування кальцієвої залежності функціональних відповідей секреторних клітин слинних залоз ми досліджували ефекти активації холінорецепторів invivoтаinvitro. Встановлено (табл.1) виражене зростання швидкості слиновиділення та білково-ферментного вмісту слини після внутрішньочеревного введення тваринам М-холіноміметиків – карбахолу (2 мкг/кг) та пілокарпіну (2 мг/кг). Агоніст Н-холінорецепторів цитизин (2 мг/кг) спричиняв підвищення лише амілолітичної активності слини на 88 9 % (n=10; р<0,01), тоді як швидкість слиновиділення зменшувалась на 51 8 % (n=12; р<0,001). Блокування холінорецепторів атропіном (2 мкг/кг) супроводжувалось зменшенням швидкості слиновиділення на 74 6 % (n=17; р<0,001) та амілолітичної активності слини – на 73 9 % (n=13; р<0,001), а при попередньому його введенні атропін повністю елімінував стимулюючий ефект агоністів.

Одержані результати підтверджують важливу функціональну роль М-холінорецепторів у стимуляції секреції рідинного компоненту слини підщелепною слинною залозою, а також вперше показують фізіологічну роль Н-холінорецепторів, при активації яких відбувається пригнічення секреції рідкої слини, а виділяється невелика кількість слини з високим вмістом ферментів.

Loading...

 
 

Цікаве