WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Дисфункція ендотелію, стан агрегації тромбоцитів та гемодинамічні зміни у хворих на q-інфаркт міокарда з гострою серцевою недостатністю (автореферат) - Реферат

Дисфункція ендотелію, стан агрегації тромбоцитів та гемодинамічні зміни у хворих на q-інфаркт міокарда з гострою серцевою недостатністю (автореферат) - Реферат

Особиста участь автора в одержанні результатів, викладених в дисертації. Дисертантом виконаний весь викладений в дисертації об'єм експериментів по вивченню впливу арбускулярних мікоризних грибів на здатність рослин поглинати радіонукліди, отримані та випробувані інокуляти АМ грибів з Чорнобильської зони відчуження, проведено аналіз отриманих результатів та сформульовано висновки. Спільно з науковими керівниками проведено вибір напрямку досліджень та обговорення результатів наукової роботи. Результати виконаних автором досліджень відображені у публікаціях в співавторстві з науковими керівниками завідуючим відділом академіком Гродзинським Д.М. та к.б.н. Сорочинським Б.В., та співробітниками Кучмою О.М, Козировською Н.О.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові результати доповідались на: Міжнародній конференції "Fifteens Years after the Chernobyl Accid. Lessons Learned" (Київ, 2001), ''IV Congress on Radiation Research''(Москва, 2001), на щорічній науковій конференції інституту ядерних досліджень НАН України (Київ, 2001), ESNA XXXII (Варшава, 2002), VIII конференції молодих вчених "Сучасні напрямки у фізіології та генетиці рослин" (Київ, 2002 ), "2nd International Workshop on Bioavailability of Soil Pollutants and Risk Assessment" (Ascona, Switzerland, 2003), на ІІІ з'їзді з радіаційних досліджень (Київ, 2003).

Публікації. Результати дисертаційних досліджень представлено 13 друкованими працями, серед яких 6 статей у фахових виданнях та 7 тез доповідей у збірках матеріалів вітчизняних та міжнародних симпозіумів, конгресів, конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію побудовано за загальною структурою. Дисертація викладена на 166 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 36 рисунками та 16 таблицями, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів, розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих даних, висновків та списку використаних джерел ( 183 найменувань).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень

У роботі використовувалипрепарати арбускулярних мікоризних грибів виду Glomus intraradices (штам GV), який був отриманий нами з університету міста Кьольн, Німеччина. В подальшому інокулюм продукували, культивуючи рослини чорнобривців (Tagetes patulus), що колонізували отриманими препаратами АМ грибів. Експерименти проводили з рослинами кукурудзи (Zea mays), райграсу (Lolium italicum), сорго (Sorghum vulgare), люцерни (Medicago sativa), щириці ( Amarantus sp.). З ризосфери рослин, які були зібрані з різних частин Чорнобильської зони відчуження, були виділені спори АМ грибів, які використовували для отримання інокулятів штамів АМ грибів-акумуляторів радіонуклідів з метою їх подальшого використання в фіторемедіації забруднених грунтів.

Питому активність 137Cs визначали на гамма-спектрометрі Canberra (США). Визначення радіонукліду 90Sr виконували прямим методом за допомогою радіометра NRR – 610, який передбачає попередню підготовку зразків проб грунту та рослин і приготування досліджуваних зразків до радіохімічного виділення 90Sr. Всі визначення радіоактивності в зразках проводили в Чорнобильському науково-технічному центрі міжнародних досліджень України, м. Чорнобиль.

Рівень колонізації рослин АМ грибами визначали під мікроскопом після фарбування корінців лактофенолом блакитним. Кількісний аналіз пофарбованих структур АМ грибів проводили методом, що був запропонований Giovanetti and Mosse [1980], та методом з використанням п`яти класів систем по Trouvelot [1986].

Виділення зразків ДНК з коріння рослин проводили СТАБ методом [Varma, 1998]. Для проведення ПЛР використовували виділену попередньо з мікоризованого коріння тотальну ДНК або ж окремі, попередньо роздавлені, спори грибів. Ампліфікацію проводили з праймерами ITS1 та ITS4. Ці праймери є комплементарними до генів рДНК, а саме до ділянок внутрішніх транскрибуючих спейсерів (ITS) [White,1990]. Регіони ITS являють собою консервативні послідовності, що мають високу видоспецифічність [Bruns, 1991]. Завдяки високій багатокопійності їх зручно використовувати для ампліфікації поодинокого гена [White, 1990]. Структура використаних праймерів:

ITS1-TCCGTAGGTGAACCTGCGG,

ITS4 - TCCTCCGCTTATTGATATGC.

Ампліфікацію проводили на ампліфікаторі "Терцик" (Росія). Режим ампліфікації: денатурацію ДНК здійснювали при 94 оС на протязі 1,5 хв., після чого проводили 5 циклів ампліфікації в режимі 94 оС - 10 сек., 68 оС - 10 сек., 72 оС - 20 сек., та 40 циклів ампліфікації в режимі 94 оС - 5 сек., 68 оС - 5 сек., 72 оС - 5 сек. та завершували ампліфікацію при 72 оС протягом 5 хв. Отримані ITS - ампліфіканти аналізували за допомогою рестриктного аналізу. Для рестрикції нами були використані наступні ферменти AluI, HinfI, HpaII, BsuRI, TagI (MBI Fermentas) [Hildebrant, 1999; Hildebrant, 2001; Redecker, 1997]. Електрофорез отриманих продуктів ампліфікації та після їх рестриктного аналізу здійснювали в 1,7 % агарозі (Chemapol, Чехія) при 45 В/199 мА протягом 40 хв.

За допомогою впровадженої методики реєстрації характеристичного рентгенівського випромінювання [Лебедь, 2002] отримані PIXE (particle induced X-ray emission) спектри і двокоординатні карти, що їм відповідають, (250 х 250 мкм) розподілу Сs+ і К+ у тонкому поперечному зрізі коренів кукурудзи (Zea mays), які були попередньо інокульовані спорами АМ гриба G. intraradices. Ці досліди проводили в Інституті ядерних досліджень, м. Краків, Польща.

Для отримання достовірних даних досліди повторювали 5 - 6 разів. На графіках нанесені величини довірчих інтервалів, які відповідають 95%-вому рівню достовірності.

Результати досліджень та їх обговорення

Отримання та аналіз інокулята. Одним із завдань нашої роботи було отримати та проаналізувати інокулят АМ грибів виду Glomus intraradiсes, штам GV. Арбускулярні мікоризні гриби пропагують, культивуючи їх з різними трав`янистими рослинами, що виступають у ролі рослин-господаря. Субстрат для культивування, що містить грунт, спори, частини коріння рослин та фрагменти гіфів грибів може бути використаний як інокулюм для лабораторних та польових експериментів. Носіями для отримання інокульому можуть виступати різноманітні пористі матеріали, такі як перліт, цеоліт, церазит та інші. В наших експериментах ми отримували інокулят, культивуючи рослини чорнобривців (Tagetes patulus). Найкращі результати (колонізація більше 95%) були отримані із застосуванням цеоліту як носія (рис. 1).

Спостереження за динамікою росту грибів дало можливість визначити час максимального розвитку мікоризи, який становить близько 80 днів культивування (рис.1).

Коріння колонізованих АМ грибами рослин фарбували лактофенолом блакитним, що давало змогу візуалізувати всі грибні структури: міцелій, везикули, арбускули, коілс (рис.2).

Рис. 1. Динаміка колонізації рослин Tagetes patulus у процесі отримання інокулята АМ грибів

Рис. 2. Загальний вигляд колонізованого АМ грибами коріння чорнобривців

Для підтвердження того, що отриманий інокулят містить гриби Glomus intraradiсes, проводили ПЛР аналіз зі специфічними праймерами ITS1 та ITS4, комплементарними до генів рДНК, а саме до ділянок внутрішніх транскрибуючих спейсерів (ITS).

Отримані продукти ампліфікації, а саме ампліфіканти розміром 560 п.н., характерні для Glomus intraradiсes ( White, 1990) та підтверджують, що отриманий інокулят ідентичний вихідному (рис.3).

Рис. 3. ПЛР - аналіз зі специфічними праймерами (ITS1 та ITS4) ДНК спор, виділених з ризосфери Tagetes patulus з вихідного інокулята (1) та отриманого інокулята (2), M- маркери МВ (Gene Ruler 100bp DNA ladder plus)

Експерименти з інокулюмом арбускулярних мікоризних грибів виду Glomus intraradiсеs. Метою першого етапу експериментів з АМ грибами було відібрати рослини, які мали б високу спорідненість до використаного виду АМ грибів і могли б при цьому продукувати велику біомасу, що важливо для їх подальшого застосування у фіторемедіації.

Аналіз отриманих результатів дає змогу зробити висновок, що кукурудза, райграс та сорго мають найбільшу спорідненість з використаними нами АМ грибами виду G.intrаradices, а саме із штамом GV. Подальші дослідження з накопичення радіонуклідів ми проводили з цими рослинами, та з рослинами чорнобривців, які також мали високі показники колонізації АМ грибами.

Отриманий інокулят був використаний в експериментах з вивчення впливу АМ грибів на акумулюючу здатність рослин стосовно радіонуклідів. Рослини вирощували на різних типах грунту з різним вмістом радіоцезію та радіостронцію: на дерново-підзолистому оглеєному грунті, дерново-підзолистому супіщаному грунті та дерново-підзолистому грунті.

Найбільший рівень накопичення радіонуклідів був отриманий в експериментах на дерново-підзолистому супіщаному грунті. Це можна пояснити тим, що у піщаному грунті як 137Cs так і 90Sr знаходяться в більш рухомій, тому і в більш доступній для рослин формі (рис. 4, 5).

Вважаємо, що досить суттєвим є правильний вибір часу, коли відбираються зразки для визначення радіоактивності, оскільки в кінці сезону вегетації цілком можливий зворотний відплив метаболітів (як радіоцезію, так і радіостронцію) з рослин в грунт [Кучма, 1994].

Loading...

 
 

Цікаве