WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Прогнозування та профілактика дисбіозу у вагітних з прееклампсією (автореферат) - Реферат

Прогнозування та профілактика дисбіозу у вагітних з прееклампсією (автореферат) - Реферат

Аналіз результатів розрахунку (СКВ, радіус обертання, вторинна структура та ін.) свідчить про високу ідентичність поведінки протеази ВІЛ-1 в обох системах. СКВ між їхніми кінцевими конформаціями є нижчим, відносно початкової структури (1,4 та 2,5 , відповідно).

Аналіз конформації активного центру протеази ВІЛ-1 у системі Asp_salt виявив, що іон натрію вбудовується між карбоксильними групами каталітичних аспартилових амінокислотних залишків Asp25/Asp25' (рис.2).

Рис. 2. Суперпозиція оптимізованих структур активного центру ВІЛ-1 протеази в системах Asp_salt (чорний колір) та AspH_cions (темно-сірий колір) з конформацією кристалічної структури протеази (світло-сірий колір)

Таке зв'язування призводить до нейтралізації електростатичного відштовхування та загалом стабілізує систему. Проведена оптимізація геометрії активного центру методом ab initio цих двох систем та накладання їх на кристалічну структуру показали високу схожість отриманих конформацій.

Механізм стабілізації протеази ВІЛ-1 через зв'язування з іоном натрію ми вважаємо дуже ймовірним, а можливе конкуренте зв'язування молекули води (як у попередніх розрахунках) пояснює факт зниження загальної стабільності та активності протеази у нейтральному рН порівняно із слабокислим.

Розрахований з МД параметр впорядкування, S2, для зв'язку N-H пептидної групи узгоджується з отриманим із даних ЯМР як якісно, так і кількісно (рис. 3).

Для цього нами було розроблено та використано програму для розрахунку параметра впорядкування, S2, для N-H зв'язку пептидної групи, який можна отримати незалежно як із даних ЯМР, так і МД, і який є індикатором рухливості білка в наносекундному часовому діапазоні. Узагальнений параметр упорядкування S2, є мірою рухливості амідних N-H зв'язків амінокислотних залишків. Ця величина може бути визначена з даних ЯМР-релаксації, але також може бути розрахована з траєкторій МД. В даній роботі такий розрахунок для кожного амінокислотного залишку здійснювали за відомою формулою (Chandrasekhar et al., 1992):

,

д

S2

е φij – кут між напрямками орієнтації амідного N-H зв'язку в моменти часу i та j, P2(x) – поліном Лежандра 2 ступеня, N – кількість пар моментів часу, які сумуються. Усереднення проводили двома способами. За першим способом траєкторію розбивали на відрізки тривалістю TR пс. Вищевказану формулу застосовували до всіх пар конформацій в даному часовому відрізку. Одержані значення S2за всіма відрізками усереднювали. За другим способом усереднення проводили за всіма парами конформацій, для яких різниця у часі була меншою, ніж TR. Показано, що значення S2, одержані неалежно двома способами, мало відрізняються між собою. При значенні TR=100-200 пс результати розрахунку задовільно узгоджуються з експериментальними даними, одержаними методом ЯМР (Freedberg et al., 2002).

Залишок

Рис. 3. Параметр впорядкованості S2 для зв'язку N-H пептидної групи залежно від номера залишку. Дані ЯМР – чорний колір, дані розрахунку МД – сірий колір

2.2. Матриця різниць. Складність вивчення впливу дистальних мутацій полягає у тому, що їхній вплив практично неможливо оцінити звичайними методами аналізу розрахунків МД. З цією метою було розроблено метод порівняння колективних рухів двох систем. Суть методу полягає у тому, що порівнюється набір тільки узгоджених рухів двох білків. У останніх теоретичних працях (Piana et al., 2002) показано, що колективні рухи протеази ВІЛ-1 впливають на взаємодію з лігандом та її каталітичну функцію. Ми припустили, що дистальні мутації можуть впливати саме на такі рухи, не змінюючи суттєво загальний фолдинг протеази. Кожен білок, що порівнювали, проходив такі етапи. Спочатку для траєкторії протеази ВІЛ-1 було проведено коваріаційний аналіз, результатом якого було розкладання рухів протеази за власними векторами. Напрям та власне значення векторів відображають напрям та амплітуду відповідного колективного руху атомів протеази. Після цього траєкторію відфільтровували тільки по перших чотирьох „найвагоміших" власних векторах, тобто в отриману траєкторію вносять вклад тільки ці обрані вектори. Далі будували динамічну крос-кореляційну матрицю (ДККМ) для відфільтрованої траєкторії, яка відображає попарну узгодженість рухів атомів білка в цьому розрахунку МД (рис. 4а). На останньому етапі такі матриці двох систем віднімали одну від одної та проводили оцінку їх розбіжності (рис. 4б).

а б

Рис. 4. а – Динамічна крос-кореляційна матриця (ДККМ) по перших чотирьох власних векторах. Осі абсцис та ординат відповідають номерам амінокислотних залишків (1-198). Кореляцію (в оригіналі) закодовано кольором від червоного (рух двох атомів паралельний) до синього (рух атомів антипаралельний). б – Карта різниць ДККМ (КР-ДККМ). Різницю закодовано кольором: зелений колір відповідає відсутності різниці, червоний чи синій відповідають максимальній різниці

Проведене тестування цього алгоритму свідчить про те, що вибір чотирьох власних векторів є оптимальним для даного білка. Цей алгоритм також дозволяє визначити амінокислотні залишки, для яких відбуваються зміни їхніх корельованих рухів.

Аналіз даних МД нативної протеази за різних умов з використанням КР-ДККМ підтверджує модель будови протеази ВІЛ-1, що складається з 5 доменів (Rose, 1998). Обидві субодиниці утворюють димеризаційний домен, що містить каталітичну діаду Asp25/25' та є основою для узгоджених рухів протеази (рис. 5).

3. МД мутантів протеази ВІЛ-1 та порівняння з нативною протеазою. Мутанти протеази ВІЛ-1, які були вивчені в даній роботі, умовно поділено за назвами доменів: Leu10Ile та Leu90Met – димеризаційний домен, Ala71Val, Gly73Ser та Ile93Leu – корові домени, Met36Ile, Glu35Gln, Ser37Asp та Arg57Lys – флепові домени. Для розрахунків МД мутантів було обрано закриту конформацію вільної протеази ВІЛ-1 (найбільш точна структура PDB ID: 1G6L). Як для нативного ферменту, так і для мутантів протеази було розраховано МД протягом 10-ти нс за умов слабокислого рН та 0,15 М концентрації NaCl. У розрахунку МД нативної протеази ВІЛ-1 виявлено високу рухливість флепових доменів (СКВ=3,16 ), що підтверджує пологий профіль їхнього конформаційного простору. МД усіх досліджених мутантів протеази ВІЛ-1 було порівняно з цією МД нативної протеази як референтної.

Рис.5. Доменна структура протеази ВІЛ-1

3. 1. МД Leu10Ile та Leu90Met мутантів протеази ВІЛ-1. Виявлено, щоповедінка цих 2 мутантів у процесі МД відрізняється кардинально: конформація мутанта Leu10Ile залишилася близькою до початкової (СКВ=2,01 ), а мутант Leu90Met виявив найвищу серед вивчених мутантів конформаційну рухливість (СКВ=3,30 ). Поведінка мутанта Leu10Ile залишалась стабільною протягом усього розрахунку МД, орієнтація доменів один відносно іншого залишалась майже незмінною, а також не відбувається суттєвих рухів всередині самих доменів. Під час вивчення динаміки мутанта Leu10Ile виявлено зниження локальної гнучкості сусідніх до мутантної амінокислоти залишків. Це унеможливлює конформаційний перехід залишку Pro9 та всієї N-кінцевої петлі протеази ВІЛ-1 у повністю відкриту конформацію (рис. 6).

а б

Рис. 6. Ефект мутації Leu10Ile на просторову структуру N-кінцевої петлі протеази ВІЛ-1. Кристалічна форма позначена сірим кольором, кінцеві конформації після 10 нс динаміки - чорним кольором: а – нативна протеаза; б – мутант Leu10Ile

В свою чергу ми показали, що повне відкриття з конформаційним переходом Pro9 N-кінцевої петлі чітко корелює з глобальним рухом на відкриття флепів нативної протеази. Отже, мутація Leu10Ile перешкоджає рухам, необхідним для відкриття активного центру протеази та стабілізує закриту конформацію протеази ВІЛ-1. З іншого боку, у мутанта Leu10Ile значно посилюються глобальні рухи протеази (від λ1=0,38 у нативної протеази, до 0,76 у мутанта), що сприяє каталітичній функції ферменту. Це спостереження збігається з даними про те, що мутант Leu10Ile виявляє більшу каталітичну ефективність, ніж нативна протеаза (Ohtaka et al., 2003). За допомогою конформаційного аналізу та карт різниць ДККМ показано, що мутант Leu90Met вносить певні пертурбації до димеризаційного домену протеази шляхом підвищення щільності локальної білкової упаковки. Вони суттєво не впливають на загальну конформацію протеази порівняно з нативною формою (СКВ С-α атомів кінцевої конформації мутанта Leu90Met відносно кінцевої конформації нативної протеази складає 1,97 ). Однак, аналіз узгоджених рухів свідчить про те, що ця мутація збільшує залежність колективних рухів кінцевих амінокислот та каталітичної петлі від рухів α-спіралі, у кожній субодиниці окремо (рис. 7а, б).

а б

в

Рис. 7. Динамічна крос-кореляційна матриця (ДККМ): а – нативної протеази; б – мутанта Leu90Met. Виділена ділянка показує збільшення залежності рухів каталітичної петлі, N-кінцевих залишків та α-спіралі. в – Схематичне зображення зміни основних рухів молекули мутанта Met90Leu протеази ВІЛ-1. Рухи на відкриття флепів та рухи, що сприяють каталізу змінюються коливанням субодиниць навколо одна одної

Як наслідок, це приводить до часткової дестабілізації узгодженості рухів амінокислот цілого димеризаційного домену та переходу від структури з п'яти до структури з двох доменів (рис. 7в). З іншого боку, спостерігається посилення узгодженості рухів всередині нижньої та верхньої частин кожної субодиниці. У нативної протеази корельовані рухи амінокислот, що складають димеризаційний домен, чітко відокремлені від рухів корових доменів; узгодженість рухів всередині димеризаційного домену необхідна для стабільності димеру протеази. Ці дані повністю корелюють із спостереженнями, що кристалічна структура мутанта Leu90Met має мінорну різницю з нативним білком, але є менш стабільною та менш активною, ніж нативна протеаза.

Loading...

 
 

Цікаве