WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Прогнозування та профілактика дисбіозу у вагітних з прееклампсією (автореферат) - Реферат

Прогнозування та профілактика дисбіозу у вагітних з прееклампсією (автореферат) - Реферат

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися на конференціях молодих вчених (Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, Україна 2001, 2003), курсах програми WHATIF (CMBI, Неймеген, Нідерланди, 2001), на наукових семінарах групи біоінформатики Інституту біофізики та біохімії ПАН (Варшава, Польща, 2001), на наукових семінарах відділу білкової інженерії Інституту молекулярної біології та генетики НАН України, наукових семінарах групи молекулярної динаміки Університету міста Гронінген, Нідерланди (2002), І Українській науковій конференції „Проблеми біологічної та медичної фізики" ПБМФ-2004 (Харків, Україна, 2004), V Міжнародній конференції з біологічної фізики ICBP-2004 (Гетеборг, Швеція, 2004).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковано у 5 статтях у фахових наукових журналах та тезах 5 доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження, узагальнення результатів дослідження, висновків, списку цитованої літератури, який нараховує 149 найменувань. Загальний обсяг дисертації складає 136сторінок, вона містить 44 рисунки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи. Для проведення розрахунків МД та моделювання структур мутантів використано просторові моделі напіввідкритої (PDB ID: 1ННР) та закритої (PDB ID: 1G6L) конформацій протеази ВІЛ-1. Напіввідкриту конформацію протеази ВІЛ-1 (1ННР) використовували для проведення розрахунків тільки нативної протеази за різних умов із подальшим порівнянням з літературними даними ЯМР. В свою чергу, закриту конформацію використовували для моделювання просторової структури мутантів, моделювання МД нативної протеази та змодельованих мутантів із подальшим порівнянням результатів розрахунку МД між собою.

Програмне забезпечення.

Для розрахунку параметра впорядкування, S2, розроблено власну програму на основі шаблону GROMACS. Для створення карт різниць динамічних крос-кореляційних матриць використовували програму MathCad. Для розрахунку МД у вакуумі використовували програму HyperChem.

Розрахунок МД проводили за допомогою програми GROMACS за загальним протоколом: просторову модель білка розміщували у центрі усіченого октаедра з мінімальною відстанню атомів білка до стінки бокса 1 нм. Потім проводили мінімізацію енергії протягом 200 кроків. Після цього бокс заповнювали молекулами води (модель SPC216) та, де було необхідно, вводили в систему відповідну кількість іонів шляхом заміщення певних молекул води. Потім проводили мінімізацію енергії і потім здійснювали розрахунок МД протягом 50 пс з гармонійною прив'язкою важких атомів протеази ВІЛ-1 до їхніх положень. Розрахунок МД проводили з кроком 2 фс, та інтегрування за алгоритмом Верлета. Результати через кожну 1 пс записували у вихідний файл.

Для оптимізації геометрії методом ab initio на рівні теорії HF/6-31G+(d,p) використовували програму PC-GAMESS. Для конструювання моделі активного центру використовували координати залишків Leu24(тільки карбонільна група)-Asp25-Thr26-Gly27 з обох субодиниць (PBI ID: 1HHP). Літичну молекулу води було розміщено над карбоксильними киснями згідно з літературними даними. При моделюванні депротонованої протеази іон натрію поміщали у положення атома кисню літичної молекули води.

Розрахунки проводили на базі таких комп'ютерних кластерів: TGV, Entry та HPC. Кластер TGV було створено на базі трьох комп'ютерів відділу білкової інженерії Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, кластер Entry був люб'язно запропонований компанією Entry (м.Київ www.entry.kiev.ua), доступ до кластеру HPC було надано університетом м.Гронінген, Нідерланди.

Результати дослідження та їх обговорення.

1. МД нативної протеази та порівняння з даними ЯМР. Для вивчення впливу мутацій на МД протеази ВІЛ-1 необхідно мати чітке уявлення про конформаційну рухливість нативної форми білка. З цією метою було проведено цілу низку розрахунків МД нативної протеази ВІЛ-1 з метою вивчення впливу розрахункових параметрів на її рухливість, а також МД за фізіологічних умов та в умовах експерименту ЯМР.

Для швидкого виявлення найбільш рухливих фрагментів білка було розраховано МД протеази ВІЛ-1 у вакуумі протягом 100 пс. Показано утворення так званої „динамічної кишені" на 20-й пс МД, яка формувалась амінокислотними залишками Val32, Lys45, Ile47, Gly48, Gly49, Ile50, Gly51, Gly52, Ile54, Val56, Leu76, Gly78, Pro79, Thr80 та Pro81. Завдяки шарнірному руху флепів (β-шпильки з кожної субодиниці, що накривають активний центр та контролюють доступ лігандів) у ділянці біля залишків Ile46 та Ile54 „кишеня" збільшувала свій об'єм до 1365 2. У цих розрахунках динаміки нами підтверджені експериментальні дані про нерівномірний розподіл конформаційної гнучкості у структурі протеази ВІЛ-1, отримані методами мікрокалориметрії (Todd et al., 1998).

1.1. Вплив методу розрахунку електростатичних взаємодій на МД протеази ВІЛ-1. Нами вперше показано, що конформаційна рухливість флепових доменів контролюється електростатичними взаємодіями, а крові та димеризаційний домени (нижня частина) більше залежать від ван-дер-ваальсового типу взаємодії. Для цього проведено два окремих розрахунків МД гідратованої протеази ВІЛ-1 з різними методами врахування далеких електростатичних взаємодій: радіус подвійного відсікання (РПВ, cut-off) та узагальнене реакційне поле (УРП, Generalized Reaction Field). У процесі МД за методом РПВ (9 та 14 ) спостерігалось зміщення флепів до активного центру протеази і його екранування від розчинника. Таку поведінку можна пояснити неповним врахуванням далеких електростатичних взаємодій у методі РПВ. На противагу, в розрахунку МД за методом УРП спостерігалось повне відкриття флепів на 2-й нс розрахунку. Відстань між кінцями флепів становила 11 , що є достатнім для можливого входження субстрату до активного центру (рис. 1).

Отже, для характеристики динаміки протеази ВІЛ-1 і необхідного відкриття активного центру ферменту критичним етапом є врахування далеких електростатичних взаємодій.

1.2. Вплив рН на МД протеази ВІЛ-1. Нами вперше було досліджено вплив

Рис. 1. Відкрита конформація протеази ВІЛ-1, отримана при розрахунку МД із застосуванням алгоритму врахування електростатичних взаємодій УРП

зміни рН на МД протеази ВІЛ-1. У нейтральному середовищі каталітична діада Asp25/Asp25' є депротонованою, а у слабокислому – монопротонованою. Було проведено два ідентичних розрахунки з єдиною різницею у протонованому стані каталітичної діади (монопротонована система - надалі AspH_RF, та депротонована система - надалі AspH_RF).

В результаті розрахунку Asp_RF ми спостерігали перехід у відкриту конформацію подібно до попереднього розрахунку МД (середньоквадратичне відхилення (СКВ) кінцевої конформації становить 5,48 ), але у випадку системи AspH_RF протеаза ВІЛ-1 залишилась подібною до напіввідкритої конформації (СКВ кінцевої конформації складає 2,31 ).

Показано, що в системі Asp_RF на 5-й пс МД молекула води вклинюється між каталітичними амінокислотними залишками Asp25/Asp25', щоб утворити максимальну кількість водневих зв'язків і тим самим зменшити електростатичне відштовхування між негативно зарядженими карбоксильними групами. У кінцевому підсумку вклинювання молекули води є причиною відкриття флепів за даних умов.

На противагу до цього розрахунку, у випадку системи AspH_RF, спостерігали не відкриття флепів, а тільки високу конформаційну рухливість флепового домену.

Таким чином, ми показали, що МД протеази ВІЛ-1 суттєво залежить від рН середовища, що узгоджується з наявними даними про залежність загальної стабільності та ензиматичної активності протеази ВІЛ-1 від величини рН.

1.3. Порівняння МД протеази ВІЛ-1 за умов експерименту ЯМР та фізіологічних умов. Вперше проведено розрахунок МД вільної протеази ВІЛ-1 за умов експерименту ЯМР та в фізіологічних умовах. Отримані дані порівняно з експериментальними даними ЯМР.

Було проведено розрахунок МД протеази за умов, що найточніше описують умови експерименту ЯМР (AspH_cions) та умови клітини (Asp_salt) протягом 8,5 нс. Для цього в систему AspH_cions було введено 5 іонів Cl –, каталітична діада була монопротонованою, а в систему Asp_salt було введено 29 іонів Na+ та 33 іони Cl – (що відповідає 0,15 М концентрації солі NaCl у розчині). Для досягнення високої точності розрахунку електростатичні взаємодії розраховували методом частко-граткового додавання за Евальдом (PME).

Loading...

 
 

Цікаве