WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаРізне → Прогнозування та профілактика дисбіозу у вагітних з прееклампсією (автореферат) - Реферат

Прогнозування та профілактика дисбіозу у вагітних з прееклампсією (автореферат) - Реферат

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ

Ковальський Дмитро Борисович

УДК 577.322

Вплив дистальних мутацій на конформаційну рухливість ВІЛ-1 протеази: дослідження методом молекулярної динаміки

03.00.03 – молекулярна біологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступенякандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі білкової інженерії Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Науковий керівник:

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

Корнелюк Олександр Іванович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

завідувач відділу білкової інженерії.

доктор біологічних наук, професор

Говорун Дмитро Миколайович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

заступник директора з наукової роботи,

завідувач відділу молекулярної біофізики;

доктор біологічних наук, професор

Кібірєв Володимир Костянтинович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу структури і функцій білка.

Провідна установа: Інститут біохімії НАН України імені О.В. Палладіна, м. Київ.

Захист відбудеться 25 жовтня 2005 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 в Інституті молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Автореферат розіслано 24 вересня 2005 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради О.В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Протеаза ВІЛ-1 є ключовим білком у циклі відтворення вірусу імунодефіциту людини. Її функція полягає у розщепленні двох поліпептидів gag і gag-pol та попередника білка Nef на функціонально активні білки вірусу. Показано, що інгібування протеази ВІЛ-1 призводить до формування функціонально неактивних віріонів ВІЛ (McQuade et al., 1990). Спираючись на цей факт, було створено цілу низку інгібіторів протеази ВІЛ-1, з яких 7 ефективно використовуються у клінічній практиці для терапії ВІЛ/СНІДу (Wlodawer et al., 1998). Однак, набуття вірусом імунодефіциту людини резистентності до цих інгібіторів є основною перешкодою на шляху повного одужання хворих. Вивчення молекулярних механізмів резистентності до ліків є вкрай необхідним для створення інгібіторів протеази ВІЛ-1 нового покоління, активних як проти нативного, так і резистентних штамів ВІЛ.

Численні роботи із вивчення явища резистентності ВІЛ-1 свідчать, що нечутливість до інгібіторів протеази ВІЛ-1 спричинена появою мутацій у гені самої протеази ВІЛ-1. За положенням у структурі протеази резистентні мутації поділяють на мутації активного центру та дистальні мутації - віддалені від активного центру ферменту. Оскільки мутантні амінокислоти активного центру безпосередньо беруть участь у контактах з інгібіторами, їхній вплив можна оцінити із просторової структури комплексів інгібіторів з протеазою ВІЛ-1. Однак вплив дистальних мутацій на резистентність важко оцінити на основі кристалографічних даних, оскільки різниця між кристалічними структурами дистального мутанта та нативної протеази не перевищує похибку експерименту. Раніше, у загальноприйнятій моделі резистентності протеази ВІЛ-1 вважалось, що мутації активного центру є основними чинниками явища резистентності (первинні мутації), а роль дистальних мутантів полягає у відновленні рівня ензиматичної активності (компенсуючі мутації), зменшення якого викликано первинними мутаціями. Однак останні експериментальні роботи свідчать про те, що дистальні мутації також можуть відігравати провідну роль у появі резистентності до інгібіторів (Muzammil et al., 2003). Отже, існує нагальна потреба у вивченні механізмів впливу дистальних мутацій на резистентність ВІЛ до інгібіторів. На жаль, дотепер не існує експериментального методу, який би дозволив розкрити механізм дії дистальних мутацій. Слід зазначити, що механізм впливу мутацій через зміну внутрішньомолекулярної динаміки білка та зміну конформаційних рухів може бути суттєвим при дослідженні резистентності, особливо у випадках, коли мутації майже не впливають на просторову кристалічну структуру ферменту (як у випадку дистальних мутацій протеази ВІЛ-1). Комп'ютерний метод розрахунку молекулярної динаміки (МД) надає інформацію про конформаційні рухи білка на атомарному рівні деталізації, що має значні переваги перед іншими методами. Вивчення динаміки білка є необхідною складовою процесу дослідження каталітичного механізму чи механізму інгібування ферменту. В останні роки застосування високопотужних обчислювальних кластерів та суперкомп'ютерів для розрахунків МД біологічних макромолекул та їхніх комплексів суттєво розширило можливості структурної біології.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу білкової інженерії Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (бюджетні теми 2.2.4.28„Структурно-функціональне дослідження еукаріотичної тирозил-тРНК синтетази методами білкової інженерії", № держреєстрації 0198U001314, 1998-2002 рр. та „Конформаційна рухливість та динамічний механізм впізнавання РНК еукаріотичною тирозил-тРНК синтетазою", № держреєстрації 0103V000073 2003-2007 рр.).

Мета і завдання досліджень. Метою дисертаційної роботи було вивчення конформаційної рухливості нативної протеази ВІЛ-1 за різних умов середовища та дослідження впливу дистальних мутацій протеази Leu10Ile, Leu90Met, Ala71Val/Gly73Ser/Ile93Leu та Glu35Gln/Met36Ile/Ser37Asp/Arg57Lys на її МД.

Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Вивчити вплив різних розрахункових параметрів на МД протеази ВІЛ-1 з метою їхньої оптимізації та подальшого використання для розрахунку МД нативної протеази ВІЛ-1 та її мутантів.

2. Провести дослідження МД за умов експерименту ЯМР для порівняння з наявними даними ЯМР та вивчення МД при фізіологічних умовах для подальшого порівняння з результатами розрахунку МД мутантів.

3. Розробити алгоритм порівняння даних МД та ЯМР у піко- та наносекундному часових інтервалах.

4. Розробити новий алгоритм порівняльного аналізу колективних конформаційних рухів білків, придатний для порівняння МД нативної протеази та її мутантів.

5. Провести розрахунки МД мутантів протеази ВІЛ-1 та охарактеризувати механізми впливу дистальних мутацій на конформаційну рухливість протеази.

Об'єкт досліджень: явище впливу дистальних мутацій протеази ВІЛ-1 на резистентність до інгібіторів.

Предмет досліджень: МД протеази ВІЛ-1; механізм впливу дистальних мутацій Leu10Ile, Leu90Met, Ala71Val/Gly73Ser/Ile93Leu та Glu35Gln/Met36Ile/Ser37Asp/Arg57Lys на резистентність, опосередковану зміною конформаційних рухів протеази ВІЛ-1 через порівняння динаміки мутантів і нативної протеази; вивчення конформаційного простору рухів протеази ВІЛ-1 у наносекундному часовому інтервалі .

Методи досліджень: метод МД для комп'ютерного моделювання конформаційної динаміки білків; розрахунок узагальненого параметра впорядкування; неемпіричний квантово-хімічний метод ab initio на рівні теорії HF/6-31G(d,p) для розрахунку геометрії активного центру; створений в роботі власний алгоритм співставлення колективних конформаційних рухів білків.

Наукова новизна одержаних результатів.

1. Досліджено конформаційну рухливість протеази ВІЛ-1 за різних умов, в тому числі фізіологічних, що дозволяє скласти повне уявлення про конформаційний простір протези ВІЛ-1 в наносекундному часовому інтервалі.

2. На основі розрахунку та аналізу МД резистентних дистальних мутантів та порівняння з МД нативної протеази ВІЛ-1 зроблено висновок про існування двох механізмів впливу резистентних мутацій – через перерозподіл амплітуди узгоджених рухів та через зміну доступних конформаційних рухів.

3. Розроблено алгоритм порівняння даних МД з даними ЯМР з використанням загального параметра впорядкування амідних зв'язків пептидних груп, S2, що дає краще узгодження в порівнянні з існуючими методами.

4. Розроблено метод порівняння колективних конформаційних рухів між двома системами (КР-ДККМ або Карти різниць).

Практичне значення одержаних результатів. Результати та методи, що були отримані та розроблені в даній роботі, можуть бути застосовані у науково-дослідній практиці:

1. Досліджені мутанти протеази ВІЛ-1 є найпоширенішими, тому наведені спостереження можуть бути використані для розробки лікарських препаратів – інгібіторів протеази ВІЛ-1 нового покоління, активних до нативної протеази та її мутантів, які є резистентними до інгібіторів.

2. Розроблений алгоритм порівняння результатів розрахунку МД з результатами експериментів ЯМР може бути застосований для вивчення динаміки інших білків. Методика визначення параметра впорядкування, S2, застосовується у новому алгоритмі для розрахунку параметрів ЯМР Т1, Т2 та ядерного ефекту Оверхаузера з даних МД, який створюється в нашому відділі.

3. Загальний метод порівняння узгоджених рухів двох систем на основі даних моделювання їхньої МД є універсальним і може бути застосований для вивчення зміни колективних рухів біомакромолекул внаслідок будь-яких пертурбацій як внутрішніх, так і зовнішніх.

Особистий внесок здобувача. В усіх опублікованих у співавторстві наукових працях за темою дисертації особистий внесок здобувача полягає: у власноруч проведених розрахунках МД нативної протеази ВІЛ-1 та її мутантів; моделюванні структури мутантів; визначенні умов проведення розрахунків; встановленні та налагодженні програмного забезпечення для швидкісного паралельного розрахунку МД; проведенні квантово-хімічних розрахунків; координації та співучасті у розробці алгоритмів порівняння даних МД з даними ЯМР та колективних рухів двох систем (КР-ДККМ); аналізі та інтерпретації отриманих результатів та їх зіставленні з літературними даними; обговоренні результатів; написанні наукових праць та оприлюдненні результатів на наукових конференціях. О.С. Іванова виконувала часткове написання коду програми із співставлення даних МД та ЯМР. Д.С. Каніболотський брав участь у розробці алгоритму із співставлення даних МД та ЯМР, аналізі даних МД нативної протеази при різних станах протонування каталітичної діади. Аналіз узгоджених рухів як нативної протеази, так і всіх дистальних мутантів, розробка КР-ДККМ, вдосконалення коду та алгоритму розрахунку параметра впорядкування, S2, виконані спільно з В.М. Дубиною. Автор висловлює подяку професору Алану Е. Марку (університет м.Гронінген, Нідерланди) за допомогу при підготовці розрахунків МД мутантів та обговоренні результатів МД за фізіологічних умов. Автор щиро вдячний д.б.н., професору О.І. Корнелюку за керівництво роботою, корисні поради в плануванні розрахунків та при обговоренні результатів. Одержані результати висвітлено в спільних публікаціях.

Loading...

 
 

Цікаве