WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаБіологія, Зоологія, Аграрна наука → Біологічно активні речовини рослинного походження з антибіотичними властивостями - Курсова робота

Біологічно активні речовини рослинного походження з антибіотичними властивостями - Курсова робота

натрію фосфату двозмінного ;
№2. 1000 мл м?ясопептонного бульйону (1:2), 15 г агару ,3 г натрію фосфатудвозмінного ;
№3. АГВ (сухий порошок розводимо відповідно до вказівки на етикетці).
Для проведення скринінгових досліджень заготовляють поживні середовища за певним принципом . У стерильну чашку Петрі рівномірно заливають щільне поживне середовище об'ємом 30 мл. Потім вирізають у ньому лунки однакової місткості . Засівають на чашку суспензію однієї культури , а потім в лунки вносять почергово екстракти рослин.
Для посіву досліджуваних культур на щільне поживне середовище з антибіотиками використовують штампи-реплікатори на 25 чи 50 культур.
Об'єм бактеріальної суспензії чи іншої рідини, залишеної штифтом штампа-реплікатора на відбитку поживного середовища становить 0.001-0.002 мл.
Штамп-реплікатор забезпечує стандартність результатів, зменшує число помилок і скорочує затрати часу на посів, і затрату поживних середовищ у порівнянні з іншими способами посіву.
Для посіву, позначення культур і обліку результатів застосовують трафарет на 25 чи 50 зон. Це клаптик паперу формою і величиною, рівно дну чашки Петрі. Так відбивають змочені тушшю штифти репліка тора. Місця нумерують від 1 до 25 чи 50 . Замість штампа-реплікатора можна використовувати пастерівську піпетку.
Для виконання методики необхідний термостат на 37 гр.С, побутовий холодильник +3 --5 гр.С, штативи, що не псуються при стерилізації, бактеріологічні чашки діаметром 9,5 см , бактеріологічні пробірки, преципітаційні пробірки, пастерівські і мірні піпетки, аналітичні терези, анатомічні пінцети, водяна баня, 0,5%-ний розчин NaCl, 10%-ний розчин желатину, дистильована вода.
1.1.3.Приготування поживних середовищ з антибіотиками.
При визначенні показника клінічної стійкості бактерії 1мл поживного середовища повинен містити концентрацію, рівну ? робочої (рекомендованої для застосування на практиці) концентрації антибіотика. Більш низька в порівнянні з робочими концентрація антибіотика в поживному середовищі вибрана на основі спеціальних досліджень, які показали, що після внесення антибіотика в біотоп проходить швидке зниження його концентрації.
Для приготування середовищ з антибіотиками в залежності від об'єму роботи заготовляють певну мірну кількість поживного середовища (15, 30, 45, 60, 90 мл) у пробірках чи мірних колбах.
Для антибіотиків, випущених промисловістю у сухому вигляді (порошок), в середовище вносять наважки препаратів, для рідких форм ? певні визначені об"єми насичених чи розведених розчинів. Якщо необхідно вихідні розчини розбавити, то використовують стерильну дистильовану воду.
Розплавлене поживне середовище після внесення антибіотика ретельно перемішують і розливають в 1-2 або більше чашок.
На дні стерильних чашок, приготованих для розливу агару, відмічають "верх" (нанесення прямої лінії на відстані 1см від краю), вказують назву і концентрацію антибіотика, номер партії. Готові чашки з антибіотиками можна зберігати в холодильнику тиждень. Перед посівом чашки обов"язково підсушують у термостаті протягом 30-40 хв.
При визначенні МІК (мінімальна інгібуюча концентрація) використовують метод серійних розведень препаратів у щільному поживному середовищі. Для цього готують серію поживних середовищ з різними концентраціями антибіотиків. Інтервал між концентраціями може бути подвійним. В залежності від активності антибіотика, вибирають ряд концентрацій ? від мінімальної, на якій ростуть всі штами певного виду, до максимальної, яка подавлює ріст всіх штамів даного виду.
1.1.4.Відбір і підготовка культур для дослідження
При дослідженнях в цілях вибору препаратів використовують штами від хворих з нагноєнням ран слизових оболонок, шкіри, підшкірної клітковини.
Для дослідження беруть чисті культури бактерій. При закритих процесах із одного патологічного матеріалу досліджують 2-3 культури кожного виду, що має етіологічне значення; із відкритих (зв"язаних з порожнинами або зовнішнім середовищем) патологічних процесів, в яких популяція бактерій більш гетерогенна, вибірка повинна бути більшою ? 5-10 культур.
Якщо досліджується одна культура, помилка у визначенні чутливості може досягти 50%. При великій затраті антибіотика і поживного середовища помилка не збільшується, оскільки одного виду і виділені з одного матеріалу, можна змішувати і випробовувати в одній пробі (на одній чашці з поживним середовищем може бути досліджено на чутливість до антибіотиків 25-50 культур).
Досліджувані культури вирощують в термостаті протягом 18-20 годин на скошених поживних середовищах. Ріст культур змивають теплим стерильним розчином NaCl з 0.1%-ним розчином желатину і стандартизують до 850млн. бактерій на мл (бактеріальний стандарт №10).
Культури одного виду і з одного матеріалу досліджують окремо або готують із них суміш в рівних об'ємах, так, щоб в 1мл суміші була така ж густина (850млн/мл).
1.1.5.Техніка посіву досліджуваних культур на середовище з антибіотиками.
Перед посівом досліджуваним культурам присвоюють номери трафарету, які заносять у протокол досліджень. Відомі 2 варіанти, які дають ідентичні результати.
Посів штампом-реплікатором.
Досліджувані культури пастерівською піпеткою вносять у лунки основи штампа-реплікатора. Порядок внесення культур повинен відповідати присвоєним їм, згідно трафарету, номерам.
Штифти штампа-реплікатора занурюють в лунки і ними роблять відбиток (для цього штифти злегка притискають до поверхні середовища і витримують 10с) на середовищі з антибіотиками: по одній чашці на кожен антибіотик при визначенні показників клінічної і біологічної стійкості, і на серію чашок з кожним антибіотиком при визначенні МІК. Для стандартної посівної дози штифти занурюють в лунки з культурою перед кожною реплікою. При серійному способі посів проводять від меншої концентрації до більшої. Одночасно роблять контрольний посів на поживне середовище без антибіотика.
Посів пастерівською піпеткою.
На фоні трафарету на 25 штамів відкритим кінцем стерильної преципітаційної пробірки в поживне середовище з антибіотиком роблять невеликі вдавлення ? стандартизуючі зони посіву.
Для посіву піпеткою вихідну культуру (850млн/мл) розводять 0.5%-ним розчином NaCl у 2 рази (до густини 425млн/мл). В зони посіву пастерівською піпеткою вносять по одній краплі суспензії досліджуваних культур. Валик, зроблений пробіркою, попереджає можливість розтікання краплі. На кожну культуру беруть окрему піпетку.
Посіви витримують на лабораторному столі до всмоктування культур, після чого поміщають в термостат при температурі 37гр.С до наступного дня.
Облік результатів проводять по наявності або відсутності росту бактерій в зонах посіву на фоні трафарету з номерами культур і у відповідності з контрольним посівом. Культура, що не дала росту на середовищі з антибіотиком, оцінюється як
Loading...

 
 

Цікаве