WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаБіологія, Зоологія, Аграрна наука → Полімеразна ланцюгова реакція (копіювання ДНК) - Реферат

Полімеразна ланцюгова реакція (копіювання ДНК) - Реферат

забруднення зразків і випадкової гомології між зондом, праймерами і послідовністю, подібною з мішенню, виходять помилково негативні результати. Проблеми, що виникають у зв'язку з перехресними реакціями за участю зонда або праймерів і можливим поліморфізмом.
Вибір контролів
Дуже важливим для правильної інтерпретації результатів є вибір контролів. Позитивні і негативні конт-ролі повинні бути добре охарактеризовані. Часто використовують ДНК із клітинних ліній, що завідомо містять чи не містять послідовність-мішень. У кожнім аналізі потрібні як мінімум три контролі:
o позитивний контроль;
o негативний контроль;
o бланк-контроль.
Бланк-контроль - це реакційна суміш, у якій присутні усі компоненти, за винятком ДНК; він є індикатором забруднень. Один тип позитивного контролю повинний містити максимальне число послідовностей-мішеней, інший - невелике їхнє число. Це дозволяє визначити чутливість і ефективність ПЛР.
У деяких випадках ампліфікація взагалі не відбувається, і якщо є підстави думати, що отриманий результат помилково негативний, дуже важко визначити, по якій саме причині. Щоб вирішити цю проблему, кожен зразок необхідно тестувати, провівши ампліфікацію якої-небудь геномної послідовності, наприклад гена рецептора ліпопротеїнів низької щільності або р-глобінового гена. При цьому розмір геномної послідовності-мішені повинний бути небагато більший, ніж досліджуваний; це дозволить переконатися, що ДНК зразка не занадто сильно деградована. При ПЛР будь-якого зразка тканин людини геномна ДНК повинна ампліфікуватися. Відсутність ампліфікації може означати інгібування ферменту, сильну деградацію ДНК чи те, що її занадто мало. У цьому випадку треба повторити ампліфікацію зразка, збільшивши і зменшивши кількість ДНК-матриці або збільшивши концентрацію ДНК-полімерази Tag. Ампліфікація може бути відсутня незважаючи на всі прикладені зусилля. Це може бути зв'язане із сильним некрозом досліджуваної тканини або фіксацією препарату не в 10% формаліні, а в інших фіксаторах. У цьому випадку єдиним виходом є повторна біопсія.
Геномні праймери можна використовувати в одному раунді ПЛР разом із праймерами, специфічними у відношенні послідовності-мішені: ампліфікація двох послідовностей йде при цьому одночасно (див. Протокол 4). Такий множинний ПЛР-тест може бути менш чуттєвим, чим той, у якому використовується один набір праймерів, але він виключає появу помилково негативного результату.
Чутливість
Визначити чутливість ПЛР-методу стосовно аналізу фіксованих і залитих у парафін препаратів досить складно. Це зв'язано з відсутністю добре охарактеризованих катаних тканин з відомим змістом послідовності-мішені, а чутливість методу при аналізі очищеної ДНК і ДНК, отриманої з фіксованих формаліном тканин, за таких самих умовах помітно розрізняється.
Однак у даний час існує можливість створювати штучні фіксовані тканини з відомим змістом послідовності-мішені на основі добре охарактеризованих клітинних ліній. Для цього змішують клітки, що містять потрібну послідовність і не містять її, суміш фіксують у формаліні і заливають у парафін. Отриманий блок нарізають і обробляють так само, як біоптати тканин, проводять ПЛР і визначають чутливість методу. І хоча цей метод не дозволяє визначити чутливість ПЛР-методу з такою високою точністю, як цього хотілося б (див. нижче), він вказує напрямок до правильної інтерпретації результатів.
Рис. 4. Чутливість ПЛР-аналіза, проведеного на фіксованих формаліном і залитих у парафін тканин.
Суміш кліток Raji (приблизно 50 копій ДНК EBV на клітку) і Molt 3 (не містять EBV) збирали центрифугування, фіксували в 10% забуференному формаліні протягом 1 год. і заливали в парафінові блоки. Робили зрізи товщиною 10 мкм, що містять приблизно по 1000 кліток, обробляли їх, і проводили ПЛР-аналіз з використанням геномних і EBV-специфічних праймерів. Продукти ампліфікації аналізували за допомогою дот-блот-гібридизації з геномним і EBV-специфічним зондами. Як і треба було очікувати, гібридизація з геномним зондом відбувалася у всіх клітинних сумішах, а з EBV-спецефічним спостерігалася тільки в суміші, у якій частка кліток лінії Raji складала 0,01, але не 0,001 або 0,0001. Таким чином, при тих умовах, у яких проводилася ПЛР, вдається виявити приблизно 10 EBV-інфікованих клітин на 1000 нормальних (число клітин, з яким проводився ПЛР-аналіз). Підвищити чутливість можна, змінивши умови проведення ПЛР або використовуючи для аналіза більшу кількість клітин.
Кількісний ПЛР-аналіз
Логічно думати, що кількість утворюваних при ПЛР ДНК корелюється з числом послідовностей-мішеней в аналізованому зразку. Однак так буває не завжди. Часто такі виключення спостерігаються при роботі з препаратами тканин, залитими в парафін: у цьому випадку число факторів, що впливають на ефективність ампліфікації, особливо велике. Це може бути природа тканини, спосіб фіксації і її тривалість, час, що пройшов від моменту одержання тканини до її фіксації, "вік" парафінових блоків, розмір зрізу, кількість виділеної і використаної для ПЛР ДНК.
Часто клінічні зразки отримують в умовах, далеких від оптимальних, що теж утрудняє проведення кількісного аналізу, особливе визначення абсолютної кількості послідовності-мішені. Для таких препаратів розроблений простий відносний метод, заснований на ПЛР-аналізі декількох розведень препарату ДНК. Для цього готують послідовні десятикратні розведенням ДНК у воді і проводять ампліфікацію в умовах, що дозволяють одержати максимальну чутливість; число циклів ПЛР при цьому може досягати 50. Такий аналіз дозволяє оцінити мінімальне число послідовностей-мішеней у препараті, оскільки при досить сильному розведенні ампліфікація повинна припинитися. Якщо паралельно проводити ампліфікацію якої-небудь геномної послідовності, то можна визначити співвідношення між числом клітин і числом послідовностей-мішенів. При відомому числі клітин у препараті (наприклад, у препараті СМЖ) інтерпретацію результатів проводять так, як це описано в табл. 2.
Таблиця 2. Визначення чутливості методом розведення
Число ампліфікованих кліток Послідовність-мішень Геномна послідовність Інтерпретація
100000 + + 1 мішень/100000 кліток
10000 + + 1 мішень/ 10000 кліток
1000 + + 1 мішень/ 1000 кліток
100 + + 1 мішень/ 100 кліток
10 + + 1 мішень/10 кліток
1 + + Мішень практично
у кожній клітці
0 - - Система працює нормально
Точна кількість кліток в останніх розведеннях визначити неможливо внаслідок помилок у піпетуванні і пуассонівському розподілу числа клітин. Геномні послідовності повинні ампліфікуватися і детектуватисяна рівні приблизно 1 клітини. У цьому випадку, якщо послідовність-мішень міститься в 1% клітин, останнє розведення, що дає позитивний сигнал, повинне відповідати 100 клітинам.
В даний час ПЛР-тести можна ставити тільки в спеціально оснащених клінічних лабораторіях. Зразки тканин, одержувані при звичайних хірургічних операціях, фіксують формаліном і заливають у парафін. Такі препарати можна досліджувати методом ПЛР, що при необхідності дозволяє провести молекулярно-генетичний аналіз без заморожування і збереження препаратів.
Loading...

 
 

Цікаве