WWW.REFERATCENTRAL.ORG.UA - Я ТУТ НАВЧАЮСЬ

... відкритий, безкоштовний архів рефератів, курсових, дипломних робіт

ГоловнаБіологія, Зоологія, Аграрна наука → Іонні механізми потенціалу дії. Методи фіксації - Курсова робота

Іонні механізми потенціалу дії. Методи фіксації - Курсова робота

Дослідження провідності одиночних калієвих і натрієвих каналів під час потенціалу дії проводилися в умовах фіксації потенціалу ділянки мембрани. Спостережувані при цьому принципи роботи окремих каналів відповідають результатам, отриманим раніше в експериментах з фіксацією потенціалу цілої клітки: при деполяризації ймовірність відкриття натрієвих і калієвих каналів зростає. Зростання ймовірності відбувається з тим же тимчасовим ходом, що й відповідні струми в умовах фіксації потенціалу. Так, натрієві канали найбільше часто відкриваються на початку деполяризуючого імпульсу й імовірність таких відкриттів падає в міру розвитку натрієвої інактивації.

Первісний короткочасний викид струму являє собою ємнісний струм, обумовлений зміною заряду на мембрані в результаті зміни мембранного потенціалу. Якщо підсилювач зворотного зв'язку здатний проводити більші струми, то ємнісний струм триває дуже недовго. На практиці викид ємнісного струму триває близько 20 мс, і за ним треба невеликий, але стійкий вихідний струм.

Цей вихідний струм, що протікає через провідності, активні при потенціалі спокою, називається струмом витоку. Здебільшого це струм іонів калію й натрію, що має лінійну залежність від величини зсуву потенціалу фіксації від потенціалу спокою й з на всьому протязі стрибка потенціалу. Більшу частину часу, однак, цей струм замаскований іншими, набагато більшими по величині іонними струмами.

Ходжкін і Хакслі показали, що друга й третя стадії струму обумовлені спочатку входом іонів натрію, а потім виходом іонів із клітини. Їм також удалося виділити індивідуальні компоненти струму й розрахувати їхню величину й часовий хід. Одним із зручних способів домогтися цього послужило видалення з розчину більшої частини іонів натрію й заміна їх на іони холіну (які не проходять через мембрану). Знизивши зміст позаклітинного натрію, удалося домогтися того, що натрієвий рівноважний потенціал зрівнявся з деполяризованим мембранним потенціалом. Таким чином, сумарний струм зрівнявся нулю.

Метод петч-кламп (patch - clamp)

Наприкінці сімдесятих років XX в. Эрвін Неєр (E.Neher) і Берт Сакман (B.Sakmann) виявили, що конусоподібні скляні піпетки з діаметром кінчика 1-2 мікрона можуть утворювати контакти із клітинною мембраною (границі "мембрана - скло") з опором у декілька гігаом - це так званий гігаомний контакт. Він дозволяє ізолювати від зовнішнього середовища й від іншої частини мембрани той її фрагмент, що перебуває усередині піпетки. Відмежований піпеткою фрагмент мембрани й називається patch - "фрагмент", слово clamp (фіксація) у назві методу можна інтерпретувати і як захоплення й ізоляцію цього фрагмента, так й як фіксацію трансмембранного потенціалу в ізольованому фрагменті, або, як буде описано пізніше, потенціалу або струму на цілій клітині. У піпетку, заповнену розчином електроліту, міститься хлор-срібний електрод, другий електрод розміщується позаклітинно, в оточуючій рідини. Відмінність електричної схеми від раніше описаної для двохелектродної фіксації полягає в тім що той самий електрод використовується як для виміру різниці потенціалів, так і для подачі струму.

Величезна сфера, частина якої видна на моніторі в центрі фотографії - це клітина (овцит жаби Xenopus laevіs), що перебуває в цей момент на предметному столику мікроскопа, до нього підведена patch-піпетка, її діаметр у носика - близько 3 мікронів. Після встановлення гігаомного контакту вона ізолює фрагмент мембрани площею приблизно 7 мкм2, струм від іонних каналів у цьому фрагменті можна буде записувати.

Конфігурація "Cell-attached"

Тільки що описана конфігурація називається cell-attached patch-clamp (patch-clamp "із прикріпленою кліткою"). Вона ілюструється схемою 1.

Схема 1. Принципова схема patch-clamp у конфігурації Cell-attached.

Ця конфігурація, однак, має дві незручності. По-перше, вона не дозволяє з достатньою надійністю вимірювати, а, отже, і задавати трансмембранну різницю потенціалів - оскільки обидва електроди - як піпетковий, так і зовнішній, перебувають по одну сторону мембрани. Загалом кажучи, можна, використовуючи оточуючий розчин з іонною композицією, що повторює склад цитоплазми, деполяризувати мембрану поза піпеткою, так що різниця потенціалів між зовнішнім електродом і цитоплазмою зникне, а тоді різниця потенціалів між електродами буде дорівнювати трансмембранному потенціалу - але все це досить приблизно, тому що точний склад цитоплазми нам невідомий.

По-друге, ця конфігурація не дозволяє контролювати склад середовища поза піпеткою - там залишається цитоплазма, склад якої не цілком визначений. У силу цих причин cell-attached mode застосовується досить обмежено.

Конфігурація Іnsіde-out

Однак, якщо піпетку швидким рухом відвести від клітини, то "внутрішній" шматочок мембрани відірветься від клітини й вийде конфігурація іnsіde-out (зовнішня сторона усередині), названа так тому, що внутрішня, звичайно звернена до цитоплазми, сторона мембрани виявиться зовні - в оточуючому розчині, а зовнішня - усередині піпетки. (Схема 2) Альтернативний метод переходу в конфігурацію іnsіde-out полягає в наступному: з конфігурації cell-attached піпетку відводять плавно, формуючи із двох сторін закриту везикулу; потім піднімають піпетку в повітря й опускають у другу ванночку, із внутрішньоклітинним розчином. При переносі зовнішня мембрана везикули руйнується, у результаті формується конфігурація іnsіde-out.

Схема 2. Принципова схема patch-clamp у конфігурації іnsіde-out.

Тепер різниця потенціалів на фрагменті мембрани строго дорівнює різниці потенціалів між електродами. Очевидно, що при використанні такої модифікації піпетку заповнюють розчином, що імітує позаклітинне середовище, тоді як оточуючий розчин роблять близьким по складу до цитоплазми. При цьому, міняючи склад оточуючого розчину, можна вивчати, як такі зміни в цитоплазмі впливають на струм каналів, що цікавлять нас, - адже оточуючий розчин контактує із цитоплазматичною стороною мембрани.

Конфігурація Whole-cell

Якщо за умовами експерименту необхідно міняти склад позаклітинного середовища, можна використати конфігурацію whole cell ("англ. ціла клітина"). У цьому випадку піпетку не відводять від клітини, а подають у неї негативний тиск й у такий спосіб руйнують ізольований фрагмент мембрани.

Схема 3. Принципова схема patch-clamp у конфігурації whole-cell.

Після цього піпетка з'єднана із внутрішньоклітинним середовищем; оскільки клітина звичайно маленька, то, завдяки дифузії, склад цитоплазми незабаром виявляється ідентичним складу піпеткового розчину, тому ми, як й у попередньому випадку, знаємо як склад рідин, так і різницю потенціалів. Відзначимо, що якщо в конфігурації іnsіde-out піпетковий електрод був "позаклітинним", а внутрішній - "внутрішньоклітинним", те тепер вони помінялися ролями. З погляду вивчення струму через канали, перевага цього методу полягає в тому, що тут залишаються цілими клітинні структури й регуляторні механізми. Але є й недолік - ми вимірюємо сумарний струм всіх каналів у клітині, а не струми через одиночні канали.

Конфігурація Outsіde-out

Вирішити цю проблему дозволяє конфігурація outsіde-out (зовнішня сторона зовні). Якщо після переходу в whole-cell mode повільно відводити піпетку від клітини, мембрана не відривається відразу, а починає витягуватися в трубку (це видно на фото).

Початкова фаза переходу з Whole-cell в Outsіde-out. Перехід в outsіde-out. Заключна фаза.

Мембранна трубка стала зовсім тонкою й майже невидимою ("протуберанець" у поверхні клітини - це невелика частина цитоплазми, що залишилася в мембранній трубці). У наступну мить трубка порветься, а мембрана зімкнеться на піпетці в "вивернутому" виді - ми опинемось в конфігурації "outsіde-out"

Loading...

 
 

Цікаве